Einleitung

In diesem Artikel beschäftige ich mich mit der ersten Publikation des Masernprozesses von Enders & Peebles aus dem Jahre 1954 [1]. Ich gehe im Folgenden auf einige Aspekte der vorliegenden Publikation ein, möchte jedoch voranstellen, dass ich bisher keine Erfahrung mit dem Studium wissenschaftlicher Artikel zur Virologie habe. Insofern freue ich mich über Hinweise, sollte ich versehentlich Sachverhalte nicht angemessen oder korrekt darstellen.

Seit 1943 wurden den Autoren nach keine bedeuteten Fortschritte bei der Erforschung der Ätiologie (die Ursache für die Entstehung von Krankheiten [2]) der Masern mehr gemacht. Dieser Umstand wurde auf das Fehlen geeigneter Labormethoden zum Nachweis des Erregers zurückgeführt.

Bis 1943 wurden zahlreiche Versuche unternommen, den Erreger der Masern in niederen Tieren, Küken Embryonen und Gewebekulturen zu vermehren. Enders & Peebles bezeichneten die Ergebnisse der verschiedenen Forscher von einander abweichend oder direkt widersprüchlich. Es zeichnete sich jedoch ab, dass Affen, insbesondere M. mulatta, mäßig empfänglich für die experimentelle Inokulation (das Einbringen von Krankheitserregern in einen Organismus oder in eine Gewebekultur [3]) sind. Darüber hinaus haben Untersuchungen gezeigt, dass der Erreger, der durch bakterienhaltende Filter gelangte, in seriellen Passagen in Küken Embryonen auf unbestimmte Zeit erhalten werden konnte.

Die Passage in Eiern schien die Pathogenität des Erregers für den Menschen zu verändern, was sich in der Entwicklung einer milden und stark modifizierten Krankheit nach der Inokulation von empfänglichen Kindern zeigte. In einigen Fällen schien diese modifizierte Krankheit mit einer Resistenz gegen Masern einherzugehen.

Materialien und Methoden

Es wurden von 7 Patienten Rachenspülungen, venöses Blut und Stuhlproben so früh wie möglich nach der klinischen Diagnose der Masernerkrankung entnommen. Nach Möglichkeit sollten die untersuchten Patienten mit 10-15 ml steriler und neutralisierter fettfreier Milch gurgeln. Proben aus dem Rachen von jüngeren Kindern wurden mit einem zuvor in Milch angefeuchteten Wattestäbchen gewonnen. Nach dem Abstrich des Rachens wurde der Tupfer in 2 ml Milch getaucht.

Das aus den Rachen gewonnenen Probenmaterial wurde mit Penicillin und Streptomycin (Antibiotikum) behandelt und dann für eine Stunde bei 5450 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit und das in einem kleinen Volumen Milch resuspendierte Pellet wurde als Inokula in Mengen von 0,5 ml bis 3,0 ml verwendet. Unter einer Suspension versteht man dabei ein heterogenes Stoffgemisch aus einer Flüssigkeit und darin fein verteilten Festkörpern [4].

Das venöse Patientenblut wurde mit 2 ml 0,05%iger Heparinlösung je 10 ml Vollblut versetzt und als Inokula für Gewebekulturen (0,5 ml bis 2,0 ml) verwendet.

Nach der Zugabe von Antibiotikum wurden aus den Stuhlproben durch Zermahlen in Fruchtwasser von Rindern Suspensionen erhalten. Anschließend erfolgte bei 5450 U/min die Zentrifugation für etwa eine Stunde. Der Überstand wurde in Mengen von 0,1 ml bis 3 ml als Inokula verwendet.

Gewebekulturtechniken   

Zur Isolation und zur Passage des vermuteten Masernerregers wurden stationäre Zellkulturen aus mit Trypsin (Eiweiß spaltendes Enzym) behandelten Menschen- und Rhesusaffennieren verwendet. Das Kulturmedium bestand aus Rinderfruchtwasser (90 %), Rinderembryoextrakt (5 %), Pferdeserum (5 %), Antibiotika und Phenolrot als ein Indikator für den Zellstoffwechsel. Der Flüssigkeitswechsel erfolgte gewöhnlich in Abständen von 4 bis 5 Tagen. Zur histologischen Untersuchung des Zellwachstums wurde die Kultur mit 10%igen Formalin fixiert, in Kollodium eingebettet, dehydriert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.

Zytopathische Veränderungen, hervorgerufen durch Erreger, die aus Masernfällen isoliert wurden

Der erste von acht Erregern, die aus Blut oder Rachenspülungen von Masernfällen gewonnen wurden und welche nach Enders & Peebles vergleichbare Eigenschaften aufwiesen, wurde nach Zugabe von Blut eines studierten Falles in Kulturen aus menschlichem Nierengewebe isoliert. In jeder der dreien beimpften Kulturen zeigten sich am 7. Tag nach der Inokulation sogenannte zytopathische Veränderungen.

Unter dem sogenannten zytopathischen Effekt versteht man die morphologische Veränderung, also einer Änderung der Form oder Erscheinung der Zellen bzw. des Zellrasens [5].

Nach den Autoren wiesen diese Veränderungen ein charakteristisches Erscheinungsbild auf, welche bis dato nicht mit einem Virus in Verbindung gebracht wurden. Der zytopathische Effekt bildete die Grundlage für weitergehende Studien der isolierten Erreger. Die detaillierte Beschreibung der beobachteten Zellveränderungen, welche man in der Publikation von Enders & Peebles in der Sektion „Experimental. Cytopathic changees induces by agents isolated from cases of measles“ einsehen kann, soll hier nicht näher dargestellt werden. Ich möchte jedoch eine Passage der Autoren hier explizit aufführen.

„Concomitantly the central portion of the nucleus came to be occupied by an apparently homogeneous substance, acidophilic in character, that approximated closely to the chromatin ring. Since in these and other preparations that have been examined subsequently no clear unstained zone has been observed between the chromatin and this acidophilic mass, it cannot be asserted that the latter represents an intranuclear inclusion body of the type characteristically associated with viral infections.“

Insbesondere kann also nicht behauptet werden, dass es sich bei dem beobachteten Phänomen im Zellkern um einen Einschlusskörper handelt, wie er typischerweise bei Virusinfektionen vorkommt. Weiter gaben die Autoren zu bedenken, dass die beschriebenen Effekte nach einer relativ langen Zeit der Inkubation von 14 bis 21 Tagen auftraten.

Biologische Eigenschaften der aus Masernpatienten isolierten Erreger

Ursprung der Erreger

Wie bereits mehrfach erwähnt, wurden die Erreger sowohl aus Blut als auch aus Rachenspülungen gewonnen. Fäkale Suspensionen wurden ebenfalls mit der Gewebekulturtechnik untersucht, in keinem Fall konnte jedoch ein Erreger im Sinne einer durch Patientenmaterial induzierten morphologischen Veränderung der Zellen in Kultur nachgewiesen werden.

Zytopathogener Bereich

Die oben angedeuteten morphologischen Veränderungen konnten ausschließlich in Gewebekulturen, welche aus Affennierengewebe gewonnen wurden, reproduziert werden. Der zytopathische Effekt zeigte sich nach Zugabe von Blut oder Rachenspülungen von Masernfällen oder nach der Zugabe von Gewebekulturflüssigkeiten früherer Passagen. Die Autoren schlossen daraus, dass Nierenepithelzellen Kulturen von Affen in gleicher Weise wie Kulturen aus menschlichen Nierenepithelzellen zur Untersuchung dieser Erreger dienen könnten. Dennoch gaben Sie zu bedenken,

„In so doing, however, it must be borne in mind that cytopathic effects which superficially resemble those resulting from infection by the measles agents may possibly be induced by other viral agents present in the monkey kidney tissue or by unknown factors.“,

d.h. es muss insbesondere in Betracht gezogen werden, dass die beobachteten Zellveränderungen anderen Ursprungs waren.

Ansteckungsversuche mit Mäusen und Küken Embryonen

Zwei Würfe weißer Mäuse wurden einen Tag nach der Geburt mit infektiöser Gewebekulturflüssigkeit sowohl intraperitoneal (die, vom Bauchfell überzogenen Strukturen [6]) als auch intrazerebral (innerhalb des Gehirngewebes [7]) geimpft. Die Tiere blieben während einer Beobachtungszeit von 21 Tagen gesund. Auch Versuche mit Küken Embryonen blieben erfolglos.

Diskussion

Der Vollständigkeit halber möchte ich noch darauf hinweisen, dass weitere Untersuchungen z. B. zur Bestimmung der Infektiosität der Erreger, dem Verhalten der Erreger bei der seriellen Passage oder die Neutralisation der Erreger eingehender untersucht wurden. An dieser Stelle wird jedoch auf eine Beschreibung verzichtet, da hier der mögliche Nachweis des Masernvirus im Vordergrund steht.

Nach den beiden Autoren Enders & Peebles sprachen einige Fakten dafür, dass die von ihnen beschriebenen Erreger für die Masernkrankheit verantwortlich sind. So wurden experimentell übertragbare Erreger, die eine vergleichbare zytopathogene Wirkung in Gewebekulturen menschlicher oder affenartiger Nierenepithelzellen zeigten, aus Blut oder Rachenspülungen isoliert, die von 5 der 7 typischen Masernfällen während der frühen akuten Phase stammten. Sie hielten es für unwahrscheinlich, dass Viren, die nichts mit Masern zu tun haben, regelmäßig im zirkulierenden Blut dieser Personen vorhanden waren, die zudem geografisch weit voneinander entfernt ihren Lebensmittelpunkt hatten.

Die pathologischen Veränderungen, die durch die Erreger in Zellkulturen induziert wurden, ähnelten denen, die in bestimmten Geweben während des akuten Stadiums der Masern gefunden wurden. Sie merkten jedoch an, dass die Faktoren in vivo (im lebendigen Organismus), die zu den beschriebenen Veränderungen führten, nicht die gleichen sein müssen, die in vitro (außerhalb eines lebendigen Organismus) zugrunde liegen. Enders & Peebles schrieben weiter:

„Although we have thus already obtained considerable indirect evidence supporting the etiologic role of this group of agents in measles, 2 experiments essential in the establishment of this relationship remain to be carried out. These will consist in the production of measles in the monkey and in man with tissue culture materials after a number of passages in vitro sufficient to eliminate any virus introduced in the original inoculum. The recovery of the virus from the experimental disease in these hosts should then be accomplished.“

Sie forderten also insbesondere den Nachweis erfolgreicher Ansteckungsversuche mit Masern beim Affen und beim Menschen mit Gewebekulturmaterialien nach einer gewissen Anzahl von Passagen in vitro, die ausreichen, um jegliches im ursprünglichen Inokulum eingebrachtes Virus zu eliminieren.

In der vorliegenden Publikation wurde das mutmaßliche Masernvirus in der Gewebekultur möglicherweise vermehrt und der Nachweis für die Infektiosität erbracht. Die Autoren gaben jedoch zu bedenken, dass die dargestellten Ergebnisse als vorläufig zu betrachten sind und weitere Studien zur Absicherung unabdingbar sind.

Die Urheber der vorliegenden Publikation setzten die „Vermehrung des Erregers“ in der Gewebekultur ohne weiteren Kommentar mit der Isolation desselben gleich. Von einem naiven Standpunkt aus würde man unter der Isolation eines vermutlichen Krankheitserregers durchaus etwas anderes Verstehen, nämlich die Trennung des Erregers von sämtlichen nicht viralen Bestandteilen und anschließender (biochemischer und genetischer) Charakterisierung. Insbesondere da die Vermutung naheliegt, dass auch die Autoren sich unter einem Virus ein abgrenzbares Partikel vorstellten, wie bei ihrer ausführlichen Beschreibung der morphologischen Veränderungen deutlich zu werden scheint.

Die Gewebekulturen wurden mit Antibiotikum behandelt, um eine mögliche bakterielle Infektion auszuschließen. Es ist jedoch bekannt, dass antibiotikaresistente Bakterien existieren, sodass nicht zwingend von einer „reinen“ Gewebekultur ausgegangen werden kann. Diesen Umstand bemerkten auch Enders & Peebles und zogen in Betracht, dass auch andere Gründe zu den beobachten Veränderungen geführt haben könnten.

Es wurden keine Kontrollexperimente dokumentiert. So ist es durchaus natürlich zu fragen, ob die Zugabe von Blut oder Rachenspülungen gesunder Probanden nach identischem Protokoll auch zu entsprechenden Zellveränderungen führen können. In dem Artikel „Den Experimenten von Enders auf der Spur – zytopathischer Effekt in Affennierenzellen ist nicht maservirusspezifisch“ [8] wird die Durchführung von Kontrollexperimenten beschrieben, nach denen auch andere Agentien als das behauptete Masernvirus zu einer Zellverschmelzung mit anschließendem Zelltod in Zellkulturen führen können.

„Im Ergebnis konnte in Abhängigkeit der zugesetzten, nicht-viralen und nicht-infektiösen Substanzen, zu verschieden Zeitpunkten Änderungen der Zellmorphologie beobachtet werden, die seit 1954 mit der „Isolation“ des „Masern-Virus“ gleichgesetzt wird.“

Der Autor des Artikels, ein Laborleiter eines unabhängigen Labors ins Deutschland, blieb anonym. Daher bin ich interessiert an weiteren veröffentlichen Quellen, in denen entsprechende Kontrollexperimente und deren Ergebnisse dokumentiert sind.

Da nur bei 5 der 7 Probanden eine Vermehrung des vermeintlichen Masernvirus der Gewebekultur dokumentiert werden konnte, wurde folglich keine hundertprozentige Infektiosität festgestellt. Hier stellt sich die Frage, warum bei 2 der 7 Probanden kein Erregernachweis glückte.

Abschließend möchte ich auf die Darstellungen von Herrn Prof. Dr. Walach in seinem Artikel „Was ist eine „wissenschaftliche Tatsache“? Ein kleines Fallbeispiel: Der „Masernprozess“ [9] verweisen. Herr Prof. Dr. Walach beschäftigte sich ebenfalls eingehender mit den sechs Publikation, die Gegenstand des Masernprozesses waren.

Bei Fragen, Anmerkungen oder Hinweisen freue ich mich über eine Nachricht.


[1]        Enders, J.F. & Peebles, T.C. (1954) Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 86 (2): 277–286.

[2]        Ätiologie (Medizin). Dez. 2020. url: https://de.wikipedia.org/wiki/%C3%84tiologie_(Medizin).

[3]        Inokulation. Aug. 2019. url: https://de.wikipedia.org/wiki/Inokulation.

[4]        Suspension (Chemie). Jan. 2021. url: https://de.wikipedia.org/wiki/Suspension_(Chemie).

[5]        Zellkultur. url: https://www.uni-giessen.de/fbz/fb10/institute_klinikum/institute/virologie/diagnostik/untersuchungen/untersuchungsverfahren/zellkultur.

[6]        Intraperitoneal. Juli 2017. url: https://de.wikipedia.org/wiki/Intraperitoneal.

[7]        Intrazerebral. Apr. 2019. url: https://de.wikipedia.org/wiki/Intrazerebral.

[8]        Lanka, Stefan. „Den Experimenten von Enders auf der Spur – zytopathischer Effekt in Affennierenzellen ist nicht maservirusspezifisch“. In: WISSENSCHAFFTPLUS – Das Magazin 4/2017, S. 13 – 17.

[9]        Walach, Harald. (17) Was ist eine „wissenschaftliche Tatsache“? Ein kleines Fallbeispiel: Der „Masernprozess“. März 2020. URL: https://harald-walach.de/methodenlehre-fuer-anfaenger/17-was-ist-eine-wissenschaftliche-tatsache-ein-kleines-fallbeispiel-der-masernprozess/.